Domanda : Buongiorno di seguito si riportano i seguenti chiarimenti: 1) Sul Capitolato speciale all’ Art. 6 Obiettivi della fornitura e caratteristiche della Fornitura. Si richiede quanto segue: In particolare, il sistema richiesto verrà utilizzato per processare i tamponi nasofaringei che arrivano in laboratorio in singolo o in serie con necessità di refertazione entro al massimo 90 minuti dal caricamento del campione sulla strumentazione e/o per test di conferma di tamponi positivi, anche questi da eseguire in emergenza. Invece nell’Allegato A Requisiti indispensabili al punto 1) REQUISITI INDISPENSABILI DEL SISTEMA ANALITICO al punto A.1.7 si richiede quanto segue: “ Tempo di processazione dal caricamento dei campioni al risultato non superiore a 70 min” Quale requisito si deve prendere in considerazione ? 2) Sul Capitolato speciale all’ Art. 6 Obiettivi della fornitura e caratteristiche della Fornitura. Si richiede quanto segue: La strumentazione deve essere multicanale, in numero tale da disporre di almeno 10 canali complessivamente, di cui almeno 4 utilizzabili ad accesso continuo (fornitura di almeno n.4 strumenti se i dispositivi non sono ad accesso continuo). Invece nell’Allegato A Requisiti indispensabili al punto 1) REQUISITI INDISPENSABILI DEL SISTEMA ANALITICO al punto A.1.4 si richiede quanto segue: Piattaforma analitica modulare. Devono essere offerti uno o più strumenti analitici per un totale di almeno 8 campioni processabili in contemporanea e in modo totalmente indipendente con accesso random 3) Il Capitolato richiede un sistema basato su PCR. In molti casi, questo termine viene usato correntemente anche per indicare un sistema di amplificazione generico, al di là della specifica tecnologia. Riteniamo che il sistema di amplificazione utilizzato nei kit per diagnosi rapida, che intendiamo proporre in questa gara, sia del tutto equivalente ad altri sistemi di amplificazione basati sulla tecnologia della Polymerase Chian Reaction (PCR). Inoltre il sistema che intendiamo proporre presenta le specifiche tecniche richieste (target, sensibilità, tempistiche di esecuzione, etc). Alleghiamo una relazione tecnica che descrive il sistema per dettagliare le basi su cui riteniamo sostenibile il principio di equivalenza. Chiediamo quindi se la proposta configurata su questo tipo di piattaforma sia ammissibile in base alle richieste del Capitolato di gara Relazione Tecnica Illustrativa La soluzione proposta prevede la fornitura di n strumenti (nome dello strumento e codice), ciascuno dei quali in grado di eseguire fino a 16 campioni in un tempo di 50 minuti, dall’inizio della procedura all’ottenimento dei risultati. I campioni sono alloggiati in 16 celle indipendenti (moduli), che operano in una logica di completo random access. I sedici moduli posson operare sia in tempi indipendenti, sia in parallelo, e possono essere caricati con il campione biologico in qualsiasi momento durante il funzionamento degli altri moduli. I moduli possono eseguire in parallelo in modo indipendente diversi protocolli; è quindi possibile eseguire test diversi, con diversi target, sullo stesso campione o su campioni diversi, nel corso della stessa seduta analitica. I kit sono basati sull’utilizzo di cartucce monouso, che eseguono sia la fase di estrazione del campione, sia le successive fasi di retrotrascrizione (nel caso di virus o altri target a RNA), sia quella di amplificazione e rilevazione. La procedura richiede semplicemente il carico del campione sulla cartuccia precaricata con il sistema di lisi ed estrazione, e l’alloggiamento della cartuccia nell’apposito modulo sullo strumento attuatore. Un codice QR stampigliato su ogni cartuccia di un determinato kit viene letto da un lettore laser incorporato nello strumento, che attiva il corrispondente programma di esecuzione del test. Il lettore può riconoscere, registrare e gestire anche l’ID del campione primario se codificato con un codice a barre o un QR code. L’attivazione del test richiede semplicemente l’avvio del processo con un comando di “START”. Lo strumento, che presenta un’interfaccia estremamente semplice da gestire e interrogare, fornisce infine i risultati del test e i parametri rilevanti della seduta analitica. I risultati possono essere stampati da una stampante dedicata, interfacciata con lo strumento. Un programma dedicato, su PC integrato nel sistema, consente la gestione in parallelo di diverse unità e l’interfacciamento con il LIS delle singole unità operative. Il test identifica due geni virali (gene N e gene Orf1ab) e un gene endogeno housekeeping di controllo (G3PDH), per monitorare l’efficienza del test in caso di campioni negativi. La sensibilità del test è di 200 copie virali / mL. La tecnologia utilizzata nei kit è costituita da una reazione di amplificazione isotermica, e l’emissione del segnale è di tipo fluorimetrica in tempo reale (Real Time Isothermal Amplification). Lo strumento esegue nel programma i cicli termici programmati necessari per le fasi di estrazione, retrotrascrizione, ove richiesta, e amplificazione. La procedura analitica completamente chiusa, la configurazione della cartuccia, che viene gestita interamente dallo strumento senza ulteriore intervento dell’operatore dopo il carico del campione, rende virtualmente inesistente il rischio di contaminazioni ambientali o da contaminazione da altri campioni, eliminando il rischio di falsi postivi. La presenza di controlli interni endogeni (geni presenti nel genoma umano, che derivano da cellule che sono normalmente presenti nei prelievi dei campioni biologici nei casi di pertinenza relativi ai prodotti offerti) monitorizza la corretta esecuzione del test e dello stesso campione biologico. L’inadeguatezza del campione biologico viene registrata dallo strumento, che invalida il test nel caso il campione biologico non sia rappresentativo, e quindi non presenti (nei campioni negativi) una adeguata amplificazione dei controlli interni. Trattandosi di una reazione isotermica, e non suddivisa in cicli termici ripetuti come nel caso della convenzionale PCR, i valori relativi all’andamento del segnale non sono espressi in Ct (ciclo soglia, o threshold cycle), ma relativamente al tempo trascorso e ai tempi di rivelazione ripetuta del segnale fluorescente generato dalla reazione, denominato Tt anziché Ct, con utilizzo del tutto equivalente. I risultati sono restituiti in tempo reale sulla schermata, che presenta le curve di amplificazione, e infine elaborati e classificati automaticamente dallo strumento e presentati in schermata, ed eventualmente su altri dispositivi collegati ed integrati, al termine del test. La tecnologia isotermica alla base della procedura, brevettata, è definita “Cross Priming Amplification”. Le prestazioni analitiche della tecnologia sono, in termini di sensibilità, specificità e accuratezza, estremamente competitive e robuste. Il meccanismo della reazione consente di ottenere risultati moto netti in tempi rapidi. Il processo di amplificazione, immediatamente successivo alla estrazione e attuato dalla stessa cartuccia, richiede solo 30 minuti. L’intero processo, come sopra indicato, richiede in tutto meno di 50 minuti. La natura isoterma della reazione garantisce inoltre maggiore robustezza sia al processo analitico, sottoposto a minori variabili, sia alla strumentazione, sottoposta ad un minore stress termico e meccanico rispetto alla convenzionale Real Time PCR. L’insieme di queste caratteristiche, riassumibili in flessibilità, random access, semplicità operativa, modularità delle soluzioni attuative e operative, unite all’originalità e alle particolari prestazioni del sistema analitico descritto e della tecnologia sottostante, rendono questo sistema una piattaforma originale e innovativa, che si presta a situazioni diversificate e modulari. Inoltre, grazie alle sue caratteristiche, offre contemporaneamente livelli qualitativi e soluzioni operative che uniscono i vantaggi dei test basati su logica POCT e alla diagnostica di emergenza, alle esigenze di processi analitici basati su numerosità elevata e variabile di analisi. L’insieme di queste caratteristiche consente anche di utilizzare questa piattaforma per gestire agevolmente e convenientemente flussi di lavoro e carichi operativi variabili nel tempo. La tecnologia CPA, protetta da una serie di brevetti totalmente indipendenti dalla LAMP o da altre tecnologie di amplificazione isotemiche (Cross priming amplification of target nucleic acids – Brevetto EP2382330A1), è pure una reazione isotermica, ma che sfrutta un principio e un meccanismo completamente diverso da altre tecnologie note. E' basata sulla interazione di diversi primer con il DNA target (o con il cDNA derivante da RNA retrotrascritto nel corso della stessa reazione), che porta alla creazione di una serie intermedia di prodotti di amplificazione, che fungono poi da substrato continuo per successive interazioni e amplificazioni da parte dei primer. La dinamica molecolare con cui si producono questi intermedi è completamente diversa dalla tecnologia LAMP e da altre tecnologie isotermiche. Infine il segnale di amplificazione specifica è generato da una o più sonde indipendenti, marcate con un fluoroforo. Il segnale positivo è perciò generato da un ulteriore evento di legame specifico tra una sonda e il target, e non da una reazione che si determina aspecificamente su tutto il DNA eventualmente presente nel campione e amplificato dal sistema, come avviene invece nel caso della tecnologia LAMP, e quindi del tutto assimilabile, da questo punto di vista, alle tecnologie di amplificazione e rilevazione del segnale Real Time basate su un sistema di amplificazione PCR (Polymerase Chain Reaction). La tecnologia LAMP, ad esempio, utilizza un insieme di primer che creano una serie di prodotti di sintesi, a partire dal DNA target ove presente, su cui agisce un meccanismo di formazione di loop che favoriscono la continua rimozione e neosintesi di frammenti di DNA complementari al target. Il segnale di amplificazione è determinato dal legame aspecifico di molecole fluorescenti al DNA, o dalla reazione con determinati reagenti da parte del pirofosfato prodotto dalla incorporazione dei nuncleotidi durante la sintesi del DNA, e non, come nel caso della CPA, da un evento specifico di ibridazione della sonda fluorescente al DNA target. Sebbene il principio e il meccanismo in base al quale avviene l’amplificazione del segmento target di acido nucleico (DNA o RNA, in quest’ultimo caso integrando una reazione di retrotrascrizione dell’RNA in cDNA) sia diverso, esso si basa comunque sull’utilizzo di primer e sonde specifiche, e su una continua specifica autogenerazione dell’amplicone derivante dall’acido nucleico originale, e sull’utilizzo di sonde fluorescenti specifiche per il target, che generano il segnale solo in seguito a legame specifico con il target, esattamente come nella tecnologia real time PCR. La differenza sostanziale consiste nel fatto che si tratta, anziché di un processo ciclico diviso in step ben distinti come nel caso della PCR convenzionale e della Real Time PCR, di un processo continuo e autoalimentantesi, basato sul legame di diverse coppie di primers (quindi aumentando ulteriormente i livelli di specificità selettiva per il target rispetto alla PCR convenzionale) con il target e sulla replicazione del DNA mediante una DNA polimerasi. Si conferma inoltre, come riportato dal documento relative alle caratteristiche tecniche e alle istruzioni operative, che il kit EasyNAT SARS-Cov2-RNA, utilizzante la tecnologia descritta, raggiunge una sensibilità in linea con le migliori performances di altri sistemi analitici basati su Real-Time PCR. In base al principio di equivalenza, si ritiene quindi che il kit proposto abbia caratteristiche funzionali e fornisca prestazioni del tutto sovrapponibili a quelle dei prodotti basati su Real Time PCR, e che quindi possa essere ad essi assimilato ed ammesso come valida alternativa. Rimaniamo in attesa di un vostro riscontro. Distinti saluti
Risposta :
111) Il requisito da prendere in considerazione è il seguente: “Il tempo di processazione dal caricamento dei campioni al risultato non superiore a 70 min”.
2) 2) Il requisito da prendere in considerazione è il seguente: “Piattaforma analitica modulare. Devono essere offerti uno o più strumenti analitici per un totale di almeno 8 campioni processabili in contemporanea e in modo totalmente indipendente con accesso random”.
3) 3) Requisito indispensabile del sistema analitico richiesto è che questo sia basato su metodica RT- PCR (Allegato A rif. A1.1) e che debba fornire il valore di Ct per ciascun target genico (Allegato A rif. A1.8). Il sistema analitico proposto, basato su tecnologia isotermica “Cross Priming Amplification” che fornisce valori di Tt anziché di Ct (ciclo soglia, o threshold cycle), non corrisponde esattamente ai requisiti indispensabili richiesti.
Il sistema che richiediamo deve essere basato su una metodica RT-PCR che fornisce come parametro analitico un valore di Ct e non Tt che deriva da reazioni biochimiche differenti. La richiesta di avere un sistema basato su metodica RT-PCR con Ct deriva dalla necessità di confrontare i risultati ottenuti con il sistema richiesto con quelli ottenuti da altri sistemi analitici presenti in laboratorio, anch’essi basati su metodica RT-PCR con Ct. Inoltre, proprio sulla base del parametro analitico del Ct vengono effettuate valutazioni di tipo clinico, epidemiologico e gestionale a cui supporto esiste un’ampia e robusta letteratura scientifica oltre che una consolidata esperienza maturata nel corso della pandemia da SARS_CoV2 e condivisa a livello nazionale dai diversi laboratori di riferimento e che ha portato alla stesura di algoritmi diagnostici e linee guida nazionali. L’utilizzo di una metodica isotermica che non fornisce il parametro analitico Ct non permetterebbe di applicare tali algoritmi diagnostici e limiterebbe la possibilità di poter effettuare quelle valutazioni cliniche, epidemiologiche e gestionali che ad oggi sono considerate una pratica consolidata nella gestione dei casi Covid-19.
